EndoFree Plasmid Maxi Kit
دا کټ د 150 - 300 ملی لیتر باکتریا محلول څخه د استخراج لپاره مناسب دی چې په شپه کې کرل شوي، د باکتریا لیز کولو لپاره د SDS-alkaline lysis میتود په کارولو سره.د خام استخراج په انتخابي ډول د یو ځانګړي انډوټوکسین سکیوینجر سره یوځای شوی او د انډوټوکسین لرې کولو لپاره د سینټرفیوګیشن لخوا جلا شوی.بیا، د سیلیکا جیل جھلی په غوره توګه د لوړ مالګې او ټیټ pH شرایطو لاندې په محلول کې د پلازمیډ DNA سره تړل کیږي.دا د ناپاکۍ او نورو باکتریاو اجزاو لرې کولو لپاره د مینځلو بفر اضافه کولو سره تعقیب کیږي.په نهایت کې، د سیلیکون میټریکس جھلی څخه د خالص پلاسمید DNA د پاکولو لپاره د ټیټ مالګې، لوړ pH اخراج بفر کارول کیږي.د سیلیکا جیل جھلی د ځانګړي جذب جھلی ګماري ، او د کالم او کالم ترمینځ د جذب مقدار توپیر خورا کوچنی دی او د تکرار وړتیا ښه ده.فینول، کلوروفارم او نور زهرجن ریجنټ ته اړتیا نشته، او نه هم د ایتانول د باران مرحلې دي.دا کټ د 0.2-1.5 ملی ګرامه خالص لوړ کاپي پلازمیډ DNA په چټکۍ سره د استخراج لپاره کارول کیدی شي، د 80٪ -90٪ استخراج نرخ سره.کټ د انډوټوکسین لرې کولو لپاره د ځانګړي پروسې فارمول کاروي ، د انډوټوکسین مینځپانګه خورا ټیټه ده او د حجرو لیږد اغیزه خورا ښه ده.استخراج شوي پلازمیډ په مستقیم ډول د انزایم هضم، PCR، د ویټرو لیږد، لیږد، ترتیب او نورو مالیکول بیولوژی تجربو کې کارول کیدی شي.
د ذخیره کولو شرایط
RNaseA باید په -30 ~ -15 ℃ کې زیرمه شي او په ≤0 ℃ کې لیږدول شي.
Endotoxin Scavenger د یوې میاشتې لپاره په 2 ~ 8 ℃ کې زیرمه کیدی شي ، د اوږدې مودې ذخیره کولو لپاره -30 ~ -15 ℃ کې زیرمه کیدی شياو په ≤0℃ کې لیږدول کیږي.
نور اجزا باید د خونې په حرارت (15 ~ 25 ℃) کې زیرمه شي او د خونې په حرارت درجه کې لیږدول شي.
اجزا
| اجزا | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| بفر P1 | 75 ملی لیتر |
| بفر P2 | 75 ملی لیتر |
| بفر P4 | 75 ملی لیتر |
| Endotoxin Scavenger | 25 ملی لیتر |
| بفر PW | 2 × 22 ملی لیتر |
| بفر TB | 20 ملی لیتر |
| FastPure DNA Maxi کالمونه (هر یو په 50ml ټولګه ټیوب کې) | 10 |
| د انډوټوکسین څخه پاک راټولولو ټیوب | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml، د RNA د لرې کولو لپاره کارول کیږي.
بفر P1:د باکتریایی تعلیق بفر ، د لومړي کارولو دمخه RNaseA بفر P1 ته اضافه کړئ.
بفر P2:د باکتریا لیسز بفر (د SDS/NaOH لرونکی).
بفر P4:بفر بې طرفه کول.
Endotoxin Scavenger:په مؤثره توګه د خام پلازمیډ استخراج څخه انډوټوکسین لرې کوي.
بفر PW:د بفر مینځل، د لومړي کارولو دمخه د ایتانول ټاکل شوي حجم اضافه کړئ.
د نري رنځ بفر:elution بفر.
FastPure DNA میکسي کالمونه:د پلازمیډ DNA جذب کالمونه.
د راټولولو ټیوب 50 ملی لیتر:د فلټر راټولولو ټیوبونه.
د انډوټوکسین څخه پاک راټولولو ټیوب:د پلازمیډ DNA راټولولو ټیوب.
چمتو شوي توکي
مطلق ایتانول، اسوپروپانول، 50 ملی لیتر ګردي لاندې سینټرفیوج ټیوب او 50 ملی لیتر انډوټوکسین څخه پاکسینټرفیوج نلونه
غوښتنلیکونه
دا محصول د 150 - 300 ملی لیتر باکتریا محلول څخه د پلازمیډونو لوی مقدار استخراج لپاره مناسب دی.په شپه کې کلتور شوی.
د تجربې بهیر
1. د 150 - 200 ملی لیتره (له 300 ملی لیتر څخه زیات نه) د باکتریا محلول په شپه کې راټول کړئ او سینټرفیوج کړئ.شاوخوا 11,000 rpm (12,000 × g) د 1 – 2 دقیقو لپاره.سپرناټینټ پریږدئ او باکتریا راټول کړئ.
Δ کله چې له 50 ملی لیتر څخه ډیر باکتریا محلول راټول کړئ، باکتریا د باکتریا محلول، سینټرفیوګیشن، د سوپرناټینټ له مینځه وړلو او نورو مرحلو کې د ورته 50 ملی لیتر ټیوب کې د اضافه کولو سره راټول کیدی شي.
څو ځله.
2. د بفر P1 7.5 ملی لیتره اضافه کړئ (مهرباني وکړئ وګورئ چې آیا RNaseA بفر P1 ته اضافه شوی) سینټرفیوج تهټیوب چې باکتریا لري او په بشپړه توګه د ورټیکس یا پایپټینګ په واسطه مخلوط کړئ.
Δ په دې مرحله کې د باکتریا بشپړ تعلیق د حاصلاتو لپاره خورا مهم دی، او د بیا تعلیق وروسته باید د باکتریا کلپونه شتون ونلري.که چیرې د باکتریا کلپونه شتون ولري چې په بشپړه توګه سره مخلوط شوي نه وي، دا به په لیسز اغیزه وکړي، په پایله کې د ټیټ حاصل او پاکوالي سبب کیږي.که د باکتریا محلول OD600 0.65 وي، نو سپارښتنه کیږي چې د 150 ملی لیتر باکتریا محلول څخه د استخراج په وخت کې 7.5 ملی لیتر بفر P1 وکارول شي؛کله چې OD600 0.75 وي، د بفر P1 8 ملی لیتره باید وکارول شي او د Buffers P2 او P4 حجم باید د دې مطابق بدل شي.که چیرې د باکتریا محلول حجم 200 ملی لیتر ته لوړ شي، نو سپارښتنه کیږي چې دد بفرونو حجم P1، P2، او P4 په متناسب ډول زیات شي.
3. 7.5 ملی لیتر بفر P2 د 2 مرحلې څخه د باکتریا تعلیق ته اضافه کړئ او په نرمۍ سره د 6 - 8 لپاره پورته او ښکته مخلوط کړئ.څو ځله او د خونې په حرارت درجه کې د 4-5 دقیقو لپاره سینګار کړئ.
Δ د ښه مخلوط کولو لپاره په نرمۍ سره وګرځوئ.وورتیکس کول به د جینومیک DNA ټوټې کیدو لامل شي ، په پایله کې په استخراج شوي پلازمیډ کې د جینومیک DNA ټوټې رامینځته کیږي.په دې وخت کې، محلول چپک او شفاف کیږي، دا ښیي چې باکتریا په بشپړه توګه لیز شوي دي.موده باید د 5 دقیقو څخه زیاته نشي ترڅو د پلازمیډونو له مینځه وړو څخه مخنیوی وشي.که د حل لاره روښانه نه وي، کیدای شي په پایله کې ډیری باکتریا ويد لیسز نیمګړتیا، نو د باکتریا اندازه باید په مناسبه توګه کمه شي.
4. د 7.5 ملی لیتر بفر P4 د 3 مرحلې څخه د بکتیریا تعلیق کې اضافه کړئ او سمدلاسه په نرمۍ سره 6 - 8 ځله وګرځوئ ترڅو محلول په بشپړ ډول د بفر P2 بې طرفه کړي.په دې وخت کې، سپین flocculent باران باید څرګند شي.د 11,000 rpm (12,000 × g) څخه زیات د 10 - 15 دقیقو لپاره سینټریفیوج کړئ، په احتیاط سره سپرناټینټ په نوي 50 ملی لیتر ګردي لاندې سنټرفیوج ټیوب کې (په ځان چمتو شوی) کې واچوئ او مخنیوی وکړئ.د تیریدلو سپینه ورېښتې تمویل کړئ.
Δ بفر P4 اضافه کړئ او سمدلاسه یې وګرځوئ ترڅو ښه مخلوط کړئ.ټیوب پریږدئ تر هغه پورې ودریږئ چې سپینه ورښت په مساوي ډول د محلول په اوږدو کې ویشل شوي وي ترڅو د ځایی باران د تولید مخه ونیسي کوم چې کولی شي بې طرفه اغیزه وکړي.که چیرې د سینټرفیوګیشن څخه دمخه یونیفورم سپین فلوکولینټ پریپییټیټ شتون ونلري او د سینټرفیوګیشن وروسته سپرناټینټ روښانه نه وي ، ټیوب کیدی شيد نورو 5 دقیقو لپاره سینټرفیوج.
5. د Endotoxin Scavenger 0. 1 ځله حجم (10٪ د سوپرناټینټ حجم، شاوخوا 2.2 ملی لیتر) د څلورم ګام څخه سوپرناټینټ ته اضافه کړئ او د مخلوط کولو لپاره بدل کړئ.محلول په یخ حمام کې ځای په ځای کړئ یا په یخ شوي یخ (یا د یخچال فریزر) کې د 5 دقیقو لپاره دننه کړئ تر هغه چې محلول له توربډ څخه پاک او شفاف شي (یا لاهمیو څه توربډ)، او کله ناکله څو ځله مخلوط کړئ.
Δ وروسته له دې چې انډوټوکسین اسکاوینجر په سپرناټینټ کې اضافه شي ، سپرناټینټ به خراب شي مګرسوپرناټینټ باید په یخ حمام کې له یخولو وروسته روښانه شي (یا یو څه توربډ)
6. وروسته له دې چې سپرناټینټ د خونې په تودوخې (>25 ℃) کې د 10 - 15 دقیقو لپاره کیښودل شي، دا به د 10 څخه تر 15 دقیقو پورې خراب شي.د هغې تودوخه د خونې د حرارت درجه ته لوړیږي.بیا سپرنټینټ باید د مخلوط کولو لپاره برعکس شي.
Δ که د خونې د حرارت درجه ټیټه وي یا تاسو غواړئ د استخراج وخت کم کړئ، سوپرناټینټ د 37 ~ 42 ℃ د اوبو حمام کې د 5 - 10 دقیقو لپاره مینځل کیدی شي او بل ګام د سپرناټینټ وروسته ترسره کیدی شي.خړوبه کیږي
7. سوپرناټینټ په شاوخوا 11,000 rpm (12,000 × g) کې د 10 دقیقو لپاره د خونې په حرارت کې (د تودوخې درجه باید> 25 ℃ وي) د مرحله جلا کولو لپاره.د اوبو پورتنۍ مرحله DNA لري پداسې حال کې چې د نیلي تیلو ښکته مرحله د Endotoxin او نور ناپاکۍ لري.د لیږدد DNA لرونکی د اوبو مرحله نوي ټیوب ته اوغوړ پرت پریږدئ.
Δ د سینټرفیوګریشن په جریان کې د تودوخې درجه باید د 25 ℃ څخه پورته وي ځکه چې د اغیزمن پړاو جلا کول نديواقع کیږي که چیرې تودوخه ډیره ټیټه وي.
Δ که چیرې د مرحلې جلا کول اغیزمن نه وي، د سینټرفیوګریشن تودوخه 30 ℃ ته تنظیم کیدی شي اود سنټرفیوګریشن وخت 15 دقیقو ته لوړ کیدی شي.
د نیلي غوړ پرت مه چوسئ ځکه چې دا انډوټوکسین او نور نجاستونه لري.
میکانیزم
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7.5 ملی لیتر بفر P1 اضافه کړئ
◇ 7.5 ملی لیتر بفر P2 اضافه کړئ
◇ 7.5 ملی لیتر بفر P4 اضافه کړئ
د Endotoxin لرې کول
◇ د Endotoxin Scavenger د سپرناټینټ حجم 0. 1 ځله اضافه کړئ
تړل او مینځل
◇ د isopropanol حجم 0.5 ځله اضافه کړئ
◇ 10 ملی لیتر بفر PW اضافه کړئ
◇ 10 ملی لیتر بفر PW اضافه کړئ
Elution
◇ 1 – 2 ملی لیتر بفر TB یا Endotoxin پاک ddH2O اضافه کړئ
