د DNA استخراج مینی کټ
دا کټ غوره شوی بفر سیسټم او د سیلیکا جیل کالم پاکولو ټیکنالوژي غوره کوي، کوم چې کولی شي د TAE یا TBE اګروز جیل مختلف غلظت څخه د 70 bp - 20 kb DNA ټوټې بیرته ترلاسه کړي.د DNA جذب کولو کالم کولی شي په ځانګړي ډول د لوړ مالګې حالت لاندې DNA جذب کړي.سربیره پردې، کټ کولی شي په مستقیم ډول د PCR محصولاتو څخه د DNA ټوټې پاک کړي، د انزیماتیک غبرګون سیسټمونه یا د نورو میتودونو لخوا ترلاسه شوي خام DNA محصولات، او ناپاکۍ لکه پروټینونه، نور عضوي مرکبات، غیر عضوي مالګې آئنونه او اولیګونیوکلیوټایډ پریمرونه لرې کړي.دا کولی شي ډاډ ترلاسه کړي چې پاکول د 10-15 دقیقو دننه بشپړ کیدی شي.پاک شوی DNA په مستقیم ډول د تړلو، بدلون، انزایم هضم، د ویټرو لیږد، PCR، ترتیب، مایکرو انجیکشن، او داسې نورو لپاره کارول کیدی شي.
د ذخیره کولو شرایط
په -15 ~ -25 ℃ کې ذخیره کړئ او د خونې په حرارت درجه کې لیږدئ.
اجزا
| اجزا | (100 rxns) |
| بفر GDP | 80 ملی لیتر |
| بفر GW | 2 × 20 ملی لیتر |
| Elution بفر | 20 ملی لیتر |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
بفر GDP:د DNA پابند بفر.
بفر GW:د مینځلو بفر؛د کارولو دمخه په بوتل کې د ښودل شوي حجم سره مطلق ایتانول اضافه کړئ.
Elution بفر:Elution.
FastPure DNA مینی کالم-G:د DNA جذب کالمونه.
د راټولولو ټیوب 2 ملی لیتر:د فلټر کولو لپاره ټیوبونه راټولول.
چمتو شوي توکي
1.5 ملی لیتر تعقیم شوي ټیوبونه، مطلق ایتانول او isopropanol (کله چې د DNA ټوټه ≤100 bp، 1 حجم اضافه کړئ
isopropanol تر 1 حجم جیل)، د اوبو حمام.
د تجربې بهیر
د بفر GW د کمولو لپاره 80 ملی لیتر ایتانول اضافه کړئ لکه څنګه چې د کارولو دمخه په ټاګ کې ښودل شوي، د خونې په حرارت کې ذخیره کړئ.
میکانیزم
1. د PCR عکس العمل حل
د جیل استخراج سکیم: د مساوي حجم بفر GDP PCR عکس العمل د بیا رغونې سکیم اضافه کړئ:د حجم بفر 5 ځله اضافه کړئ
2. GDP د جیل حجم محاسبه کړئ (100 μl مساوي 100 mg)
جیل منحل کړئ
3. په 50 ~ 55 مخکې ګرم کړئ℃
4. د مینځلو سره تړل
د بفر GDP 300 μL اضافه کړئ*
د بفر GW 700 μL اضافه کړئ
د بفر GW 700 μL اضافه کړئ
5. Elute
20-30μL د Elution Buffer یا deionized اوبو اضافه کړئ
یادونه* د دې مرحلې پرته د PCR عکس العمل مایع رغونه
د جیل استخراج پروګرام
1. د DNA الیکټروفورسیس وروسته د DNA ټوټې ټوټې کولو لپاره، د DNA ټوټه د اګرز جیل څخه د UV رڼا لاندې جلا کړئ.دا سپارښتنه کیږي چې د جاذب کاغذ وکاروئ ترڅو د جیل څرګند رطوبت جذب کړي او د امکان تر حده د اضافي اګاروز لرې کولو سره د جیل ټوټې اندازه کمه کړئ.د جیل سلائس وزن کړئ (پرته له مایکروسینټریفوج ټیوب) د هغې حجم محاسبه کړئ: د 100 ملی ګرام جیل سلائس حجم نږدې 100 μL دی ، فرض کړئ کثافت 1g/ml دی.
2. د مساوي حجم بفر GDP اضافه کړئ، د 7-10 دقیقو لپاره په 50 ~ 55 ℃ کې کیوب کړئ (د جیل اندازې سره سم، د انکیوبیشن وخت تنظیم کړئ تر هغه چې جیل په بشپړه توګه منحل شي).د انکیوبیشن په جریان کې ټیوب 2 ځله بدل کړئ.
د بفر GDP د 1-3 حجمونو اضافه کول به د DNA بیا رغونې موثریت اغیزه ونکړي.که چیرې د DNA ټوټه بیرته ترلاسه شي <100 bp، د بفر GDP 3 حجم اضافه کولو ته اړتیا لري؛کله چې د جیل ټوټه په بشپړه توګه منحل شي، د isopropanol 1 حجم اضافه کړئ او په ښه توګه سره مخلوط کړئ، بیا بل ګام ته ادامه ورکړئ.
3. په لنډه توګه سینټرفیوج کړئ ترڅو نمونه د ټیوب لاندې ته راوړو، د FastPure DNA Mini Columns-G د راټولولو ټیوب 2 ملی لیتر کې دننه کړئ، په احتیاط سره د 700 μL محلول په یو ځل انتقال کړئ.
د فلټر کولو کالمونو ته وخت، په 12,000 rpm (13,800 X g) کې د 30-60 ثانیو لپاره سینټرفیوج.
4. فلټریټ پریږدئ او کالم ته د بفر GDP 300 μL اضافه کړئ، د خونې په حرارت کې د 1 دقیقو لپاره سینټریفیوج کړئ، په 12,000 rpm (13,800 X g) کې د 30-60 ثانیو لپاره.
5. فلټریټ پریږدئ او کالم ته 700 μL بفر GW اضافه کړئ (وګورئ چې ایا مطلق ایتانول دمخه اضافه شوی!) د 30-60 ثانیو لپاره په 12,000 rpm (13,800 X g) کې سینټرفیوج کړئ.
Δ مهرباني وکړئ د جذب کالم دیوال شاوخوا Buffer GW اضافه کړئ، یا د Buffer GW شاته پوښ اضافه کړئ او د 2 - 3 ځله پورته سره مخلوط کړئ ترڅو د تیوب دیوال ته د مالګې په بشپړ ډول فلش کولو کې مرسته وکړي.
6. پنځم ګام بیا تکرار کړئ.
Δ دوه ځله د بفر GW سره فلش کول کولی شي ډاډ ترلاسه کړي چې مالګه په بشپړه توګه لیرې شوې او په راتلونکو تجربو اغیزه له مینځه وړي.
7. فلټریټ پریږدئ او خالي کالم په 12,000 rpm (13,800 X g) کې د 2 دقیقو لپاره سینټرفیوج کړئ.
8. کالم په یو پاک 1.5 ملی لیتر مایکرو سینټریفوج ټیوب کې دننه کړئ، د کالم غشا مرکز ته 20 - 30 μL ایلیوشن بفر اضافه کړئ، د 2 دقیقو لپاره سینټر کړئ او بیا په 12,000 rpm (13,800 X g) کې د 12 دقیقو لپاره سینټرفیوج کړئ.کالم پرې کړئ، ترلاسه شوی DNA په -20 کې ذخیره کړئ.
Δ د 8 مرحلې د سپرناټینټ لیږد کول د بیا ځل لپاره کالم ته او د Elution بفر 55 ته پری ګرمول (کله چې د DNA ټوټه> 3 kb) ممکن د بیا رغونې موثریت زیاتولو کې ګټور وي.
د PCR محصولاتو بیا رغونه پروګرام
دا پروتوکول د PCR محصولاتو ، انزایمیک عکس العمل سیسټم او نورو DNA خام محصولاتو (د جنیتیک DNA په شمول) څخه د DNA ټوټې پاکولو لپاره پلي کیږي.دا محلول کولی شي په اغیزمنه توګه مختلف نیوکلیوټایډونه، پریمر، پریمر ډیمر، د مالګې مالیکولونه، انزایمونه او نور ناپاکۍ لرې کړي.
1. په لنډه توګه د PCR محصولات سنټرفیوج، د انزایمیک غبرګون حل، او نور د DNA خام محصولات.د دوی حجم د پایپټ سره اټکل کړئ او یو 1.5 ملی لیتر یا 2 ملی لیتر ټیوب ته انتقال کړئ.ddH2O اضافه کړئ تر هغه چې حجم تر 100 μL پورې وي؛پداسې حال کې چې د جینومیک DNA لپاره د لوړ غلظت سره، د ddH2O سره 300 μL ته کمول به د بیا رغونې موثریت ښه کولو کې مرسته وکړي.
2. د بفر GDP 5 حجمونه اضافه کړئ، په ښه توګه د بدلولو یا ورټیکس کولو په واسطه مخلوط کړئ.که چیرې د DNA د ګټو برخې> 100 bp، د ایتانول اضافي 1.5 حجم (نمونې + بفر GDP) اضافه کولو ته اړتیا لري.
3. کالم بیرته د راټولولو ټیوب کې دننه کړئ، مخلوط کالم ته انتقال کړئ، په 12,000 rpm (13,800 ×g) کې د 30 - 60 ثانیو لپاره سینټرفیوج کړئ.که د مخلوط محلول حجم>700 µL وي، د جذب کالم بیرته د راټولولو ټیوب ته واچوئ، پاتې محلول د جذب کولو کالم ته انتقال کړئ، او د 30 - 60 ثانیو لپاره په 12,000 rpm (13,800 × g) کې سینټرفیوج کړئ.
4. راتلونکی فعالیت د 08- 1/جیل استخراج پروګرام 5 – 8 مرحلې ته اشاره کوي.
غوښتنلیکونه
د TAE یا TBE agarose جیل مختلف غلظت؛د PCR محصولات، د انزایمیک غبرګون سیسټمونه یا نور خام DNA محصولات چې د مختلفو میتودونو لخوا ترلاسه شوي.څخه ترلاسه شوي ټوټې70 bp -20 kb.
یادښتونه
یوازې د څیړنې لپاره کارول کیږي.د تشخیص پروسیجرونو کې د کارولو لپاره نه.
1. د بفر GW د کمولو لپاره 80 ملی لیتر ایتانول اضافه کړئ لکه څنګه چې د کارولو دمخه په ټاګ کې ښودل شوي، د خونې په حرارت درجه کې ذخیره کړئ.
2. که چیرې د Buffer GDP د ټیټ تودوخې ذخیره کولو په وخت کې د باران کولو لپاره اسانه وي، دا د کارولو دمخه د یوې مودې لپاره د خونې په حرارت درجه کې کیښودل کیدی شي.که اړتیا وي، دا د 37 ℃ د اوبو حمام کې مخکې له مخکې تودوخه کیدی شي تر هغه چې اورښت په بشپړه توګه منحل شي، او بیا د مخلوط کولو وروسته کارول کیدی شي.
3. مخکې له مخکې د اوبو د حمام تودوخه 50 ~ 55 ℃ ته وټاکئ.
4. په 08-1/Gel استخراج پروګرام 1 مرحله کې، د جیل ټوټې اندازه کمول به د پام وړ د تحلیل وخت کم کړي او د بیا رغونې موثریت زیات کړي (لینیر شوی DNA په اسانۍ سره د هایدرولیس کولو لپاره کله چې په دوامداره توګه په لوړه تودوخه کې ښکاره کیږي).د اوږدې مودې لپاره د DNA جیل UV ته مه ښکاره کوئ، ځکه چې د الټرا وایلیټ رڼا کولی شي DNA ته زیان ورسوي.
5. جیل په 08- 1/جیل استخراج پروګرام 2 مرحله کې په بشپړه توګه منحل کړئ، که نه نو د DNA بیا رغونې موثریت به په جدي توګه اغیزمن شي.
6. د Elution Buffer یا ddH2O تر 55℃ پورې ګرم کړئ، کوم چې د DNA elution موثریت ښه کولو کې مرسته کوي.دا سپارښتنه کیږي چې DNA په 2.5 mM Tris-HCl، pH 7.0 - 8.5 کې ذخیره کړئ.
