د نبات مستقیم PCR کټ
د بلی شمیره: HCR2020A
د نبات مستقیم PCR کټ د نبات د پاڼو، تخمونو او نورو مستقیم پراخولو لپاره مناسب دی، او د نبات د نمونو د لوړې کچې سکرینینګ لپاره کارول کیدی شي چې پالیساکریډونه او پولیفینول نلري.د مستقیم تحول DNA پولیمیریز د لارښود تکامل پراساس په نباتاتو کې د PCR مخنیوی کونکو ته غوره زغم لري.په ورته وخت کې، دا د لوړ لوړولو فعالیت ساتي، کوم چې د 5 kb دننه د DNA ټوټې پراخولو لپاره مناسب دی.په کټ کې ځانګړی Lysis بفر A د تازه یا منجمد نبات نسجونو لیز کولو لپاره کارول کیدی شي.دا کار کول اسانه دي او لیسټیټ د پاکولو پرته د امپلیفیکیشن لپاره د ټیمپلیټ په توګه کارول کیدی شي.سیسټم محافظتي اجنټان لري چې د خامو نمونو وړتیا ورکوي ترڅو په مؤثره توګه د بار بار یخولو او پړسیدو وروسته پراخه شي.2 × د نبات مستقیم ماسټر مکس یوازې د امپلیفیکیشن عکس العمل ترسره کولو لپاره پریمر او ټیمپلیټونو اضافه کولو ته اړتیا لري، په دې توګه د پایپټینګ عملیات کموي او د پایلو کشف کولو او بیا تولید وړتیا ښه کوي.
اجزا
| اجزا | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × د نبات مستقیم ماسټر مکس | 1.25 ملی لیتر | 4×1.25 ملی لیتر |
| د نبات مستقیم لیسیس بفر A | 5 ملی لیتر | 20 ملی لیتر |
| د نبات مستقیم لیسیس بفر B* | 5 ملی لیتر | 20 ملی لیتر |
*د نبات مستقیم لیسیز بفر B یو اختیاري ریاجنټ دی، کوم چې د نبات مستقیم لیسیز بفر A بې طرفه کولو لپاره کارول کیږي ترڅو د نمونو ذخیره کولو وخت اوږد کړي.دا د حقیقي وضعیت سره سم کارول کیدی شي.
د ذخیره کولو شرایط
2 × د نبات مستقیم ماسټر مکس، په -30 ~ -15 ℃ کې ذخیره کړئ او د بار بار یخولو او غوړیدو څخه مخنیوی وکړئ؛د نبات مستقیم لیسیس بفر، په -30 ~ -15℃ یا 2 ~ 8℃ کې ذخیره کړئ.
د تجربې بهیر
د نمونې پروسس کول–د نبات پاڼی
مستقیم طریقه:دا سپارښتنه کیږي چې ځوان پاڼي وکاروئ.د 0.5 - 3 ملي متر ټاکل شوي قطر سره د سوري پنچ وکاروئ ترڅو کوچنۍ او یونیفورم نمونه ترلاسه کړئ، او بیا په مستقیم ډول د PCR سیسټم ته نمونه اضافه کړئ (50 μl سیسټم سپارښتنه کیږي).یادونه، ډاډ ترلاسه کړئ چې نمونه د PCR محلول کې ده او د ټیوب دیوال په وړاندې نه ده.که مستقیم PCR د اوږدې ټوټو او پیچلو نمونو د پراخولو لپاره کارول کیږي، د نمونې په توګه د کوچني قطر (0.5 - 1 ملي میتر) سره د نمونې کارول کولی شي د غوره پایلو ترلاسه کولو کې مرسته وکړي.
د لیسز پیسولو طریقه:دا سپارښتنه کیږي چې ځوان پاڼي وکاروئ.د پاڼی یوه کوچنۍ ټوټه واخلئ (شاوخوا 1 - 3 ملی میتره قطر)، په 20 μl د نبات مستقیم لیسیس بفر اب کې کېږدئ، او د امکان تر حده یې وخورئ (دا ګام د 100 μl پایپټ ټیپ سره د پاڼی د مینځلو سره ترسره کیدی شي. نمونه میش کول).که چیرې د پاڼو نسجونو لوی مقدار وکارول شي (له 7 ملي میتر څخه زیات نه وي)، د کمولو بفر حجم 50 μl ته لوړ کړئ.وروسته له دې چې پاڼي وچې شي، محلول باید شنه ښکاري.د لنډ سینټرفیوګریشن وروسته، د عکس العمل نمونې په توګه د PCR سیسټم ته د سپرناټینټ 1 μl اضافه کړئ.
د حرارتي لیسیز طریقه:دا سپارښتنه کیږي چې ځوان پاڼي وکاروئ.د پاڼی یوه کوچنۍ ټوټه واخلئ (شاوخوا 1 - 3 ملی میتره قطر)، دا په 20 μl د نبات مستقیم لیسیس بفر A کې ځای په ځای کړئ، او د 5 - 10 دقیقو لپاره یې په 95 درجو کې تودوخه کړئ.د لیسز وخت په مناسبه توګه د هغو پاڼو لپاره پراخ کیدی شي چې لیز کول ستونزمن وي (له 20 دقیقو څخه زیات نه وي).که چیرې د پاڼو نسجونو لوی مقدار وکارول شي (له 7 ملي میتر څخه زیات نه وي)، د کمولو بفر حجم 50 μl ته لوړ کړئ.د تودوخې وروسته، په لنډه توګه سینټریفیوج کړئ، او د عکس العمل نمونې په توګه د PCR سیسټم ته 1 μl سپرناټینټ اضافه کړئ.
د نمونې پروسس کول- د کښت تخم
د لیسز پیسولو طریقه:د تخمونو د پرې کولو لپاره د سکالپیل څخه کار واخلئ د 5 ملي میتر قطر سره، دوی د نبات مستقیم لیسیز بفر A 100 μl ته اضافه کړئ، او نمونه د پایپټ ټیپ یا نورو وسیلو سره پیس کړئ.ورټیکس په لنډه توګه او پریږدئ چې د خونې په حرارت کې د 3 - 5 دقیقو لپاره ودریږئ.ډاډ ترلاسه کړئ چې د تخم نمونه د کمولو بفر کې ډوب شوي.د لنډ سینټرفیوګریشن وروسته، د عکس العمل نمونې په توګه د PCR سیسټم ته د سپرناټینټ 1 μl اضافه کړئ.
د حرارتي لیسیز طریقه:د تخمونو د پرې کولو لپاره سکالپیل وکاروئ د 5 ملي میتر قطر سره ، دوی د نبات مستقیم لیسیز بفر A 100 μl کې اضافه کړئ ، او د 5 - 10 دقیقو لپاره په 95 درجې تودوخه کې تودوخه وکړئ.د لیسز وخت په مناسب ډول د هغو پاڼو لپاره وغځول شي چې لیز کول ستونزمن وي (له 30 دقیقو څخه زیات نه وي).د تودوخې وروسته، په لنډه توګه سینټریفیوج کړئ، او د عکس العمل نمونې په توګه د PCR سیسټم ته 1 μl سپرناټینټ اضافه کړئ.
a.کینچی یا نور وسایل هم د مناسب اندازې نمونې پرې کولو لپاره کارول کیدی شي؛که چیرې پنچ یا کینچی بیا وکارول شي، دوی باید د هر کارونې دمخه د 2٪ سوډیم هایپوکلورایټ محلول سره پاک شي ترڅو د نمونو ترمینځ د کراس ککړتیا مخه ونیسي.
ب.ډاډ ترلاسه کړئ چې د نبات مستقیم لیسیس بفر د کارولو دمخه په بشپړه توګه خړوب شوی.که چیرې بفر ویسکوس وي یا باران ولري ، نو دا په 37 ℃ کې تودوخه کیدی شي ترڅو د کارولو دمخه یې په بشپړ ډول منحل کړي.
ج.د عکس العمل په سیسټم کې د ټیمپلیټ حجم د نبات د موادو حجم او اضافه شوي مقدار کې د توپیر سره سم په مناسب ډول تنظیم کیدی شي.
د نبات مستقیم لیسیس بفر
د نبات مستقیم لیسیز بفر A په دې محصول کې شتون لري په کلکه د نبات د نسجونو جینوم خوشې کولو لپاره په کلکه اصلاح شوی او په 4 ℃ کې د خام بوټو لنډمهاله ذخیره کولو لپاره مناسب دی.که نمونه د اوږدې مودې لپاره ذخیره کولو ته اړتیا ولري (د مثال په توګه 1 - 2 میاشتې) ، نو سپارښتنه کیږي چې سپرناټینټ نوي EP ټیوب ته ولیږدوي او په -20 ℃ کې زیرمه کړي.د دې لپاره چې نمونې په ډیر ثبات سره ذخیره کړئ، انتقال شوي سپرناټینټ ته د نبات مستقیم لیسیز بفر B مساوي حجم اضافه کړئ، ښه مخلوط کړئ او په -20℃ کې ذخیره کړئ.د ذخیره کولو مستحکم وخت د نبات نمونو او حالتونو سره توپیر لري.
د غبرګون سیسټم
| ddH2O | تر 20.0 μl پورې | تر 50.0 μl پورې |
| 2 × د نبات مستقیم ماسټر مکسa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| پریمر 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| پریمر 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| د نبات پاڼي / د خامو استخراج نمونه(د نمونې پروسس کولو ته مراجعه وکړئ) | 0.5 – 3 mm د پاڼی ډیسک/x µl | 0.5 – 3 mm د پاڼی ډیسک/x µl |
a.پدې کې Mg شامل دي2+د 2 mM په وروستي غلظت کې.
ب.دا سپارښتنه کیږي چې د هر پریمر لپاره د 0.4μM وروستی غلظت وکاروئ.د پریمرونو ډیر کارول به د غیر مشخص پراخوالي لامل شي.
ج.د کارول شوي نمونې مقدار د اصلي وضعیت سره سم تنظیم کیدی شي.د خام لیز شوي نمونې په یو واحد عکس العمل کې کارول شوي مقدار د عکس العمل ټول حجم 2٪ - 20٪ ترمنځ تنظیم کیدی شي.د ډیری نمونو کارول کولی شي د امپلیفیکیشن ناکامۍ لامل شي.
د غبرګون پروګرام
| ګامونه | دحرارت درجه | وخت |
| ابتدايي تخریب | 98℃ | 5 دقیقې |
| له منځه وړل | 95℃ | 10 ثانیې |
| annealing | 58 ~ 72℃ | 15 ثانیې |
| تمدید | 72℃ | 30 ثانیې |
| وروستی تمدید | 72℃ | 5 دقیقې |
a.ابتدايي تخریب (98℃، 5 دقیقې) د نبات نسج لیسز ته وده ورکوي، د جینومیک DNA خوشې کوي چې د PCR پراخولو لپاره کارول کیدی شي.وخت لنډ مه کوئ یا د تودوخې درجه کمه کړئ.
ب.دا سپارښتنه کیږي چې دا د پریمر Tm ارزښت سره مساوي یا د Tm ارزښت څخه 2 ~ 4℃ لوړ وټاکئ.په دې محصول کې کارول شوي مستقیم امپلیفیکیشن DNA پولیمیریز د دودیز تاق DNA پولیمیریز څخه توپیر لري ، او د عکس العمل انیل کولو تودوخې لپاره ځانګړي اړتیاوې لري؛ د لوړ انیلینګ تودوخې کارول کولی شي په مؤثره توګه غیر مشخص امپلیفیکیشن کم کړي او د امپلیفیکیشن موثریت ته وده ورکړي.د پیچلو ټیمپلیټونو لپاره ، د انیل کولو تودوخې تنظیم کولو او د تمدید وخت اوږدولو سره مؤثره وده ترلاسه کیدی شي.
ج.که د امپلیفیکیشن محصول اوږدوالی ≤1 kb وي، د تمدید وخت په 30 ثانیو / kb کې ټاکل شوی؛که چیرې د امپلیفیکیشن محصول اوږدوالی> 1 kb وي، د تمدید وخت په 60 ثانیو / kb کې ټاکل شوی.
d.د پیچلو نمونو یا نمونو لپاره چې د ټیټ امپلیفیکیشن حاصل سره ، د سایکلونو شمیر په مناسب ډول 40 -50 سایکلونو ته لوړ کیدی شي.
غوښتنلیکونه
دا د نبات نسجونو مستقیم پراخولو او د نبات د نمونو د لوړې کچې سکرینینګ لپاره پلي کیږي چې پولیساکریډونه او پولیفینول نلري.
یادښتونه
یوازې د څیړنې لپاره کارول کیږي.د تشخیص پروسیجرونو کې د کارولو لپاره نه.
1. د کروډ پلانټ امپلیفیکیشن یا مستقیم امپلیفیکیشن لپاره، دا سپارښتنه کیږي چې د تجربې پیل کولو دمخه د پاک جینومیک DNA د مثبت کنټرول په توګه وکاروئ ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې سیسټم، پریمرونه او عملیات سم دي.
2. مستقیم امپلیفیکیشن DNA پولیمریز په دې کټ کې کارول کیږي قوي پروف ریډینګ فعالیت لري.که د TA کلونینګ ترسره کولو ته اړتیا وي، نو سپارښتنه کیږي چې د اډینین اضافه کولو دمخه د DNA پاک کړئ.
3. د پریمر ډیزاین لارښود:
a.دا سپارښتنه کیږي چې د پریمر په 3′ پای کې وروستی بیس باید G یا C وي.
ب.د پریمر په 3′ پای کې په وروستیو 8 اډو کې د پرله پسې بې اتفاقیو څخه باید مخنیوی وشي.ج.د پریمر په 3′ پای کې د ویښتو جوړښتونو څخه ډډه وکړئ.
d.د فارورډ پریمر او ریورس پریمر د Tm ارزښت کې توپیر باید له 1℃ څخه ډیر نه وي او د Tm ارزښت باید 60 ~ 72℃ ته تنظیم شي (د پریمیر پریمیر 5 د Tm ارزښت محاسبه کولو لپاره وړاندیز کیږي).
e.اضافي اضافي پریمر ترتیبونه چې د ټیمپلیټ سره سمون نه لري، باید د پریمر Tm ارزښت محاسبه کولو په وخت کې شامل نه شي.
f.دا سپارښتنه کیږي چې د پریمر GC مینځپانګه 40٪ -60٪ وي.
g.په پریمر کې د A، G، C او T ټولیز ویش باید د امکان تر حده وي.د هغو سیمو د کارولو څخه ډډه وکړئ چې لوړ GC یا AT منځپانګې لري.
h.د پرائمر دننه یا د دوه پرائمرونو تر مینځ د 5 یا ډیرو بیسونو د تکمیلي ترتیبونو شتون څخه مخنیوی وکړئ او د دوه پرائمرونو په 3′ پای کې د 3 یا ډیرو بیسونو تکمیلي ترتیبونو شتون څخه مخنیوی وکړئ.
i.د NCBI BLAST فنکشن وکاروئ ترڅو د پریمر ځانګړتیا چیک کړئ ترڅو د غیر مشخص پراخه کیدو مخه ونیسئ.
