د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم
د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم د بیا جوړونکي E. coli فشار څخه اخیستل شوی چې د واکسینیا کیپینګ انزایم لپاره جینونه لیږدوي.دا واحد انزایم له دوو فرعي واحدونو (D1 او D12) څخه جوړ دی او درې انزیماتیک فعالیتونه لري (RNA triphosphatase او guanylyltransferase د D1 subunit په واسطه او guanine methyltransferase د D12 subunit لخوا).د ویکسینیا ویروس کیپینګ انزایم د کیپ جوړښت رامینځته کولو لپاره مؤثره دی ، کوم چې کولی شي په ځانګړي ډول د 7-میتیلګوانیلټ کیپ جوړښت (m7Gppp, Cap 0) د RNA 5′ پای ته ضمیمه کړي.د کیپ جوړښت (کیپ 0) په یوکریټس کې د mRNA ثبات، ټرانسپورټ او ژباړې کې مهم رول لوبوي.د انزیماتیک عکس العمل په واسطه د RNA کیپ کول یو مؤثر او ساده میتود دی چې کولی شي د ویټرو لیږد ، لیږد ، او مایکرو انجیکشن لپاره د RNA ثبات او ژباړې ته د پام وړ وده ورکړي.
اجزا
د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم (10 U/μL)
10×کیپینګ بفر
د ذخیره کولو شرایط
-25～- 15℃ د ذخیره کولو لپاره
د ذخیره کولو بفر
20 mm Tris-HCl (pH 8.0)، 100 mm NaCl،
1mM DTT، 0. 1mm EDTA، 0. 1٪ Triton X- 100، 50٪ ګیلیسرول.
د واحد تعریف
د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم یو واحد د انزایم مقدار په توګه تعریف شوی چې د 10pmol GTP په 37 درجې سانتي ګراد کې په 1 ساعت کې په 80nt لیږد کې شاملولو لپاره اړین دی.
د کیفیت کنټرول
Exonuclease:د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم 10U د 1μg λ-Hind III سره د DNA هضم په 37 ℃ کې د 16 ساعتونو لپاره هیڅ تخریب نه رامینځته کوي لکه څنګه چې د agarose gel electrophoresis لخوا ټاکل کیږي.
Endonuclease:د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم 10U د 1μg λDNA سره په 37℃ کې د 16 ساعتونو لپاره هیڅ تخریب نه کوي لکه څنګه چې د agarose gel electrophoresis لخوا ټاکل کیږي.
نیکس:د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم 10U د 1 μg pBR322 سره په 37 ℃ کې د 16 ساعتونو لپاره هیڅ تخریب نه رامینځته کوي لکه څنګه چې د agarose gel electrophoresis لخوا ټاکل کیږي.
RNase:10U د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم د 1.6μg MS2 RNA سره د 4 ساعتونو لپاره په 37℃ کې هیڅ تخریب نه رامینځته کوي لکه څنګه چې د agarose gel electrophoresis لخوا ټاکل کیږي.
1.کولی DNA:د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم 10U د E. coli genomic DNA د شتون لپاره د TaqMan qPCR په کارولو سره د E. coli 16S rRNA لوکس لپاره ځانګړي پریمر سره سکرین شوی.د E. کولی جینومیک DNA ککړتیا ≤1 E. coli جینوم دی.
2.باکتریا Endotoxin: LAL-ټیسټ، د چینايي فارماکوپیا IV 2020 نسخه، جیل محدودیت ازموینې میتود، عمومي اصول (1143).د باکتریا انډوټوکسین مینځپانګه باید ≤10 EU/mg وي.
د غبرګون سیسټم او شرایط
1. د کیپینګ پروتوکول (د عکس العمل حجم: 20 μL)
دا کړنلاره د 10μg RNA (≥100 nt) د کیپینګ عکس العمل لپاره تطبیق کیږي او دا د تجربوي غوښتنو سره سم اندازه کیدی شي.
I) 10μg RNA او د نیوکلیز څخه پاک H2O په 1.5 ملی لیتر مایکروفیج ټیوب کې د 15.0 μL وروستی حجم ته یوځای کړئ.*10×کیپینګ بفر: 0.5M Tris-HCl، 50mm KCl، 10mm MgCl2، 10mm DTT، (25℃، pH 8.0)
2) د 5 دقیقو لپاره په 65 ℃ کې تودوخه کړئ او د 5 دقیقو لپاره د یخ حمام وروسته.
3) لاندې برخې په ټاکل شوي ترتیب کې اضافه کړئ
| Cمخالف | Volume |
| منحل شوی RNA (≤10μg، اوږدوالی≥100 nt) | 15 μL |
| 10×کیپینګ بفر* | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم (10U/μL) | 1 μL |
*10×کیپینګ بفر: 0.5 M Tris-HCl، 50 mM KCl، 10 mM MgCl2، 10 mM DTT، (25℃، pH8.0)
4) د 30 دقیقو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې انکیوب کړئ، RNA اوس پوښل شوی او د لاندې جریان غوښتنلیکونو لپاره چمتو دی.
2. 5′ ترمینل د لیبل کولو غبرګون (د غبرګون حجم: 20 μL)
دا پروتوکول د RNA لیبل کولو لپاره ډیزاین شوی چې د 5´ ټرای فاسفیټ لري او دا د غوښتنو سره سم اندازه کیدی شي.د لیبل شاملولو موثریت به د RNA د مولر تناسب لخوا اغیزمن شي: GTP، او همدارنګه د RNA نمونو کې د GTP منځپانګې.
1) په 1.5 ملی لیتر مایکروفیج ټیوب کې د RNA او نیوکلیز څخه پاک H2O مناسب مقدار سره یوځای کړئ د 14.0 μL وروستی حجم ته.
2) د 5 دقیقو لپاره په 65 ℃ کې تودوخه کړئ او د 5 دقیقو لپاره د یخ حمام وروسته.
3) لاندې برخې په ټاکل شوي ترتیب کې اضافه کړئ.
| Cمخالف | Volume |
| رد شوی RNA | 14 μL |
| 10×کیپینګ بفر | 2 μL |
| د GTP مخلوط** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| د واکسینیا ویروس کیپینګ انزایم (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX د GTP او لږ شمیر مارکرونو ته اشاره کوي.د GTP غلظت لپاره، مراجعه وکړئیادښت 3 ته.
4) د 30 دقیقو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې انکیوب کړئ، د RNA 5′ پای اوس لیبل شوی او د لاندې جریان لپاره چمتو دی
غوښتنلیکونه
1. د ژباړې له ارزونې/ان ویټرو ژباړې مخکې د mRNA کیپ کول
2. د mRNA پای 5' لیبل کول
د کارولو په اړه یادښتونه
1.د ویکسینیا کیپینګ انزایم سره د انکیوبیشن دمخه د RNA محلول ګرمول د لیږد په 5' پای کې ثانوي جوړښت لرې کوي.د ترانسکریپټونو لپاره وخت تر 60 دقیقو پورې وغځوئ د پیژندل شوي لوړ جوړښت لرونکي 5 پایونو سره.
2. RNA د کیپینګ تعاملاتو لپاره کارول کیږي باید د کارولو دمخه پاک شي او په نیوکلیز پاکو اوبو کې وځنډول شي.EDTA باید شتون ونلري او محلول باید د مالګې څخه پاک وي.
3. د 5´ پای لیبل کولو لپاره، د GTP ټول غلظت باید په عکس العمل کې د mRNA غلظت شاوخوا 1-3 ځله وي.
4. د عکس العمل سیسټم حجم د حقیقي سره سم پورته یا ښکته کیدی شي.
