RTL Reverse Transscriptase
RTL reverse transcriptase د RNA ټیمپلیټ پورې تړلی DNA پولیمریز دی چې د 3'→5' exonuclease فعالیت نلري او د RNase H فعالیت لري.دا انزایم کولی شي RNA د ټیمپلیټ په توګه وکاروي ترڅو د DNA بشپړونکي سټنډ ترکیب کړي ، کوم چې د لومړي سټینډ cDNA ترکیب کې پلي کیدی شي ، په ځانګړي توګه د RT-LAMP (لوپ - منځګړیتوب isothermal امپلیفیکیشن) لپاره.د RTL reverse transscriptase 1.0 سره پرتله کول، حساسیت د پام وړ ښه شوی، حرارتي ثبات پیاوړی دی، او په 65 ° C کې عکس العمل ډیر باثباته دی.د RTL ریورس ټرانسکریپټیس (ګلیسیرول وړیا) د لیوفیلیز چمتووالي چمتو کولو لپاره کارول کیدی شي ، لیوفیلیز شوي RT-LAMP ریجنټ وغيره.
د واحد تعریف
یو واحد د 1 nmol dTTP په 20 دقیقو کې په 50 درجو کې د تیزاب وړ موادو کې د پولی(A)•oligo(dT)25 په توګه د ټیمپلیټ پریمر په توګه کاروي.
اجزا
| اجزا | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ریورس ټرانسکریپټیس (د ګلیسرول څخه پاک) (15U/μL) | 0.1 ملی لیتر | 1 ملی لیتر | 10 ملی لیتر |
| 10×HC RTL بفر | 1.5 ملی لیتر | 4×1.5 ملی لیتر | 5 × 10 ملی لیتر |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 ملی لیتر | 2×1.5 ملی لیتر | 3 × 10 ملی لیتر |
د ذخیره کولو حالت
تر 0°C لاندې ترانسپورت او په -25°C~-15°C کې زیرمه شي.
د کیفیت کنټرول
- د پاتې کیدو فعالیتEndonuclease:یو 50 μL عکس العمل چې 1 μg λDNA او RTL2.0 15 واحدونه لري د 16 ساعتونو لپاره په 37 ℃ کې انبیل شوي د جیل الیکٹروفورسیس لخوا د منفي کنټرول په څیر ورته نمونه ښیي.
- د پاتې کیدو فعالیتExonuclease:یو 50 μL عکس العمل چې 1 μg Hind Ⅲ هضم شوي λDNA او RTL2.0 15 واحدونه لري د 16 ساعتونو لپاره په 37 ℃ کې انکیوب شوي د جیل الیکٹروفورسیس لخوا منفي کنټرول ورته ورته نمونه ښیې.
- د پاتې کیدو فعالیتنیکیس:یو 50 μL عکس العمل چې 1 μg supercoiled pBR322 لري او د RTL2.0 15 واحدونه په 37°C کې د 4 ساعتونو لپاره انکیوب شوي د جیل الیکٹروفورسیس لخوا د منفي کنټرول په څیر ورته نمونه ښیي.
- د پاتې کیدو فعالیتRNase:د 10 μL عکس العمل چې 0.48 μg MS2 RNA لري او د RTL2.0 15 واحدونه د 4 ساعتونو لپاره په 37 درجې C حرارت کې ساتل کیږي د جیل الیکٹروفورسیس لخوا د منفي کنټرول په څیر ورته نمونه ښیي.
- ای کولی gDNA:سره اندازه شویE.coliځانګړي HCD کشف کټونه، د RTL2.0 15 واحدونه له 1 څخه کم لريای کولیجینوم
د عکس العمل تنظیم کول
د cDNA ترکیب پروتوکول
| اجزا | حجم |
| کينډۍ RNA a | اختیاري |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) یا تصادفي پریمر مخلوط (60uM) | 2 μL |
| dNTP مکس (10mm هر یو) | 1 μL |
| د RNase مخنیوی کونکی (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL بفر | 2 μL |
| له نیوکلیز څخه پاکې اوبه | تر 20 μL پورې |
یادونه:
1) د ټول RNA وړاندیز شوی خوراک 1ng ~ 1μg دی
2) د mRNA وړاندیز شوی خوراک 50ng ~ 100ng و
ترمو-د معمول لپاره د سایکل چلولو شرایط غبرګون:
| د تودوخې درجه (°C) | وخت |
| 25 °Ca | ۵ دقیقې |
| ۵۵ سانتي ګراد | 10 دقیقېb |
| 80 °C | 10 دقیقې |
یادونه:
1) که چیرې تصادفي پریمر مکس وکارول شي ، په 25 درجو کې د انکیوبیشن مرحله.
2) که د هدف پریمر مخلوط وکارول شي، د 10 ~ 30 دقیقو لپاره په 55 ° C کې د انکیوبیشن مرحله.
RT-LAMP پروتوکول
| اجزا | حجم | وروستی تمرکز |
| کينډۍ RNA | اختیاري | ≥10 کاپي |
| dNTP مکس (10mm) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP/BIP پرائمر (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 پرائمر (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB پرائمر (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/ عکس العمل |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/ عکس العمل |
| Bst V2 DNA پولیمریز (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ عکس العمل |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 mM (ټول 8 mM) |
| 10×HC RTL بفر (یا 10×HC Bst V2 بفر) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| له نیوکلیز څخه پاکې اوبه | تر 25 μL پورې | - |
یادونه:
1) د راټولولو لپاره په لنډ ډول د vortexing او سینټرفیوج په واسطه مخلوط کړئ.د 1 ساعت لپاره په 65 ° C کې د تودوخې دوامداره انکیوبیشن.
2) دوه بفرونه د ګډ کار وړ دي او ورته ترکیب لري.
یادښتونه
1. دا محصول به سپینه جامد جوړ کړي کله چې په -20 ° C کې زیرمه شي.د -20 درجې څخه یې وباسئ او د 10 دقیقو لپاره یې په یخ کې واچوئ.د خړوبولو وروسته، دا د شینګ کولو او مخلوط کولو له لارې کارول کیدی شي.
2. د cDNA محصول په -20 ° C یا -80 ° C کې زیرمه کیدی شي یا د PCR عکس العمل لپاره سمدلاسه کارول کیدی شي.
3. د RNase د ککړتیا مخنیوي لپاره، مهرباني وکړئ تجربه ساحه پاکه وساتئ، او د عملیاتو پرمهال پاک دستکشې او ماسکونه واغوندئ.
