M-MLV Reverse Transscriptase
RevScript Reverse transscriptase د جنیټیک انجینري ټیکنالوژۍ لخوا ترلاسه کیږي.دا د لوړ cDNA ترکیب وړتیا، د تودوخې ثبات او د عکس العمل د تودوخې حد (تر 60 درجې پورې) لري.ترکیب شوی cDNA محصول تر 10 kb پورې دی.دا د ټیمپلیټونو تړاو ته وده ورکوي او د پیچلي ثانوي جوړښت یا ټیټ کاپي جینونو سره د RNA ټیمپلیټونو ریورس لیږد لپاره مناسب دی.
اجزا
| اجزا | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transscriptase (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ملی لیتر |
| 5 × RevScript بفر | 250 μL | 1.25 ملی لیتر | 5 ملی لیتر |
د ذخیره کولو حالت
دا محصول باید د 2 کلونو لپاره په -25 ° C ~ - 15 ° C کې زیرمه شي.
د واحد تعریف
یو واحد د 1 nmol dTTP په 10 دقیقو کې په 10 دقیقو کې په 37 ° C کې د اولیګو (dT) د پریمر په توګه کاروي.
د عکس العمل تنظیم کول
1.د RNA ټیمپلیټ تخریب (دا مرحله اختیاري ده، د RNA ټیمپلیټ تخریب د ثانوي جوړښتونو په خلاصولو کې مرسته کوي، کوم چې به د لومړي سټینډ cDNA حاصل ته وده ورکړي.)
| اجزا | حجم(μL) |
| RNase وړیا ddH2O | تر 13 پورې |
| اولیګو (dT)18 (50 μmol/L) یا تصادفي پریمر (50 μmol/L) یا د جین ځانګړي پریمر (2 μmol/L) | 1 |
| یا 1 | |
| یا 1 | |
| د RNA ټیمپلیټ | X a |
یادونه:
1) a: ټول RNA: 1-5 ug یا mRNA: 1-500 ng
2) د 5 دقیقو لپاره په 65 ° C کې تودوخه کول، بیا سمدلاسه په یخ کې لیږدول ترڅو د 2 دقیقو لپاره یخ شي.د عکس العمل مایع راټولولو لپاره لنډ سینټرفیوګریشن، د ریورس لیږد عکس العمل محلول اضافه کړئ لکه څنګه چې په لاندې جدول کې ښودل شوي.په نرمۍ سره د مخلوط کولو لپاره پیپیټ.
1.د عکس العمل مخلوط چمتو کول (20 μL حجم)
| اجزا | حجم(μL) |
| د پخوانیو مرحلو مخلوط | 13 |
| 5×بفر | 4 |
| dNTP مکس (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transscriptase (200 U/μL) | 1 |
| د RNase مخنیوی کونکی (40 U/μL) | 1 |
1.د لاندې شرایطو لاندې عکس العمل ترسره کړئ:
| د تودوخې درجه (°C) | وخت |
| 25 °Ca | ۵ دقیقې |
| ۴۲ سانتي ګرادb | 15-30 دقیقې |
| 85 سانتي ګرادc | ۵ دقیقې |
یادونه:
1) یو.د 5 دقیقو لپاره په 25 درجې سانتي ګراد کې انکیوبیشن یوازې د تصادفي هیکسامر کارولو لپاره اړین دی.مهرباني وکړئ دا مرحله پریږدئ کله چې د Oligo (dT) کاروئ18یا د جین ځانګړي پریمر.
2) ب.د وړاندیز شوي ریورس لیږد تودوخې درجه 42 °C ده، د پیچلو ثانوي جوړښتونو یا لوړ GC مینځپانګې سره د ټیمپلیټونو لپاره، دا سپارښتنه کیږي چې د عکس العمل تودوخه 50-55 °C ته لوړه کړي.
3) ج.د 5 دقیقو لپاره په 85 ° C کې تودوخه کول د ریورس ټرانسکریټیس غیر فعالولو لپاره.
4) محصول په مستقیم ډول د PCR یا qPCR عکس العملونو کې کارول کیدی شي ، یا د لنډ مهاله ذخیره کولو لپاره -20 ° C کې زیرمه کیدی شي.سپارښتنه کیږي چې محصولات الیګوټ کړئ او د اوږدې مودې ذخیره کولو لپاره په -80 ° C کې ذخیره کړئ.د پرله پسې کنګل کیدو څخه ډډه وکړئ.
5) محصول د یو مرحلې RT-qPCR لپاره مناسب دی، دا سپارښتنه کیږي چې د هر 25μL غبرګون سیسټم لپاره 10-20 U ریورس ټرانسکریټیس اضافه کړي، یا په تدریجي ډول د اصلي حالت سره سم د ریورس ټرانسکریپټیس اندازه زیاته کړي.
یادښتونه
1.مهرباني وکړئ د تجربې ساحه پاکه وساتئ؛د عملیاتو پرمهال باید پاکې دستکشې او ماسکونه اغوستل شي.ټول مصرف شوي توکي چې په تجربه کې کارول کیږي باید د RNase څخه پاک وي ترڅو د RNase ککړتیا مخه ونیسي.
2.ټول پروسیجرونه باید په یخ کې ترسره شي ترڅو د RNA تخریب مخه ونیسي.
3.د لوړ کیفیت RNA نمونې سپارښتنه کیږي ترڅو د ریورس لیږد لوړ موثریت یقیني کړي.
4.دا محصول یوازې د څیړنې کارولو لپاره دی.
5.مهرباني وکړئ د خپل خوندیتوب لپاره د لابراتوار کوټونو او دسپوز وړ دستکشو سره کار وکړئ.
