M-MLV Neoscript Reverse Transscriptase
Neoscript Reverse Transcriptase یو ریورس ټرانسکریټیس دی چې د مولوني مورین لیوکیمیا ویروس اصلي او په E.coli کې د څرګندیدو د M-MLV جین د بدلون سکرینینګ لخوا ترلاسه شوی.انزایم د RNase H فعالیت لرې کوي، د تودوخې لوړه زغم لري، او د لوړې تودوخې ریورس لیږد لپاره مناسب دی.له همدې امله، دا د RNA د لوړې کچې جوړښت او د cDNA ترکیب باندې غیر مشخص فکتورونو غیر منفي اغیزو له مینځه وړو لپاره ګټور دی، او لوړ ثبات لري او د نقل نقل ترکیب کولو وړتیا لري.انزایم لوړ ثبات لري او د نقل نقل ترکیب کولو وړتیا لري.
اجزا
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transscriptase
2.5 × د لومړي سټرینډ بفر (اختیاري)
* 5 × فرسټ سټرینډ بفر dNTP نلري ، مهرباني وکړئ dNTPs اضافه کړئ کله چې د عکس العمل سیسټم چمتو کړئ
وړاندیز شوی غوښتنلیک
1.یو ګام qRT-PCR.
2.د RNA ویروس کشف.
د ذخیره کولو حالت
-20 ° C د اوږدې مودې ذخیره کولو لپاره، باید د کارولو دمخه ښه مخلوط شي، د بار بار کنګل کیدو څخه مخنیوی وشي.
د واحد تعریف
یو واحد د پولی(A)•oligo(dT) په کارولو سره په 10 دقیقو کې 1 nmol dTTP په 37°C کې شاملوي25د ټیمپلیټ/پرائمر په توګه.
د کیفیت کنټرول
1.د SDS-PAGE الکتروفوریټیک پاکوالی له 98٪ څخه ډیر.
2.د امپلیفیکیشن حساسیت، د بیچ څخه تر بیچ کنټرول، ثبات.
3.نه خارجي نیوکلیز فعالیت، نه خارجي انډونیوکلیز یا د خارجي نیوکلیز ککړتیا
د لومړي زنځیر عکس العمل حل لپاره د عکس العمل تنظیم کول
1.د عکس العمل مخلوط چمتو کول
| اجزا | حجم |
| اولیګو (dT)۱۲-18 پریمر یا تصادفي پریمرa یا د جین ځانګړي پریمرb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| کينډۍ RNA | ټول RNA≤ 5μg؛mRNA≤ 1 μg |
| د RNase څخه پاک dH2O | تر 10 μL پورې |
یادونه:a/b: مهرباني وکړئ د خپلو تجربوي اړتیاو سره سم مختلف ډوله پریمر غوره کړئ.
2.د 5 دقیقو لپاره په 65 ° C کې تودوخه کړئ او د 2 دقیقو لپاره په یخ کې په چټکۍ سره یخ کړئ.
3.پورتني سیسټم ته لاندې اجزاوې د 20µL ټول حجم کې اضافه کړئ او په نرمۍ سره مخلوط کړئ:
| اجزا | حجم(μL) |
| 5 × د لومړي-Strand بفر | 4 |
| Neoscript Reverse Transscriptase (200 U/μL) | 1 |
| د RNase مخنیوی کونکی (40 U/μL) | 1 |
| د RNase څخه پاک dH2O | تر 20 μL پورې |
4. مهرباني وکړئ عکس العمل د لاندې شرایطو سره سم ترسره کړئ:
(1) که تصادفي پریمر کارول کیږي، عکس العمل باید د 10 دقیقو لپاره په 25 ℃ کې ترسره شي، او بیا د 30 ~ 60 دقیقو لپاره په 50 ℃ کې ترسره شي؛
(2) که چیرې Oligo dT یا ځانګړي پریمرونه وکارول شي، عکس العمل باید د 30-60 دقیقو لپاره په 50℃ کې ترسره شي.
5.د 5 دقیقو لپاره په 95 ℃ کې تودوخه کړئ ترڅو د Neoscript Reverse Transcriptase غیر فعال کړي او عکس العمل پای ته ورسوي.
6.د ریورس ټرانسکرپشن محصولات په مستقیم ډول د PCR عکس العمل او فلوروسینس کمیتي PCR عکس العمل کې کارول کیدی شي ، یا د اوږدې مودې لپاره -20℃ کې زیرمه کیدی شي.
PCR Rعمل:
1.د عکس العمل مخلوط چمتو کول
| اجزا | تمرکز |
| 10 × PCR بفر (dNTP وړیا، Mg²+ وړیا) | ۱× |
| dNTPs (10mm هر dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA پولیمریز (5U/μL) | 2-2.5 U |
| پریمر 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| پریمر 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| کينډۍa | ≤10% د لومړي زنځیر عکس العمل حل (2 μL) |
| ddH2O | تر 50 μL پورې |
یادونه:الف: که د لومړي زنځیر عکس العمل حل ډیر اضافه شي، د PCR غبرګون ممکن مخنیوی وشي.
2.د PCR عکس العمل پروسیجر
| ګام | دحرارت درجه | وخت | سایکلونه |
| مخکې له ځنډه | 95℃ | 2-5 دقیقې | 1 |
| له منځه وړل | 95℃ | 10-20 ثانیې | 30-40 |
| annealing | 50-60℃ | 10-30 ثانیې | |
| تمدید | 72℃ | 10-60 ثانیې |
یادښتونه
1.د 42 ℃ ~ 55 ℃ حد کې د ریورس لیږد تودوخې اصلاح کولو لپاره مناسب.
2.دا غوره ثبات لري، د لوړې تودوخې ریورس لیږد امپلیفیکیشن لپاره مناسب دی.برسېره پر دې، دا د RNA پیچلي ساختماني سیمو څخه په اغیزمنه توګه د تیریدو لپاره مناسب دی.همدارنګه، داد یو مرحلې ملټي پلیکس فلوروسینس مقداري RT-PCR کشف لپاره مناسب دی.
3.د مختلف PCR امپلیفیکیشن انزایمونو سره ښه مطابقت او د لوړ حساسیت RT-PCR عکس العملونو لپاره مناسب دی.
4.د لوړ حساسیت یو ګام فلوروسینس مقداري RT-PCR عکس العمل لپاره مناسب ، په مؤثره توګه د ټیمپلیټونو ټیټ غلظت کشف کچه ښه کوي.
5.د cDNA کتابتون جوړولو لپاره مناسب.
