دوه اړخیزه RNA (dsRNA) ELISA KIT

دا کټ د انزایم سره تړلی Immunosorbent Assay (ELISA) دی چې د بایوټین-Streptavidin سیسټم سره یو ځای کیږي، د dsRNA د کمیتي اندازه کولو لپاره چې د 60 بیس پیړۍ (bp) څخه پورته اوږدوالی لري، پرته له دې چې ترتیب وي.پلیټ د dsRNA ضد انټي باډي سره دمخه پوښل شوی.په نمونه کې موجود dsRNA اضافه کیږي او په څاګانو کې پوښل شوي انټي باډیز سره تړل کیږي.او بیا د بایوټینیلیټ ضد dsRNA انټي باډي اضافه کیږي او په نمونه کې dsRNA سره تړل کیږي.د مینځلو وروسته، HRP-Streptavidin اضافه کیږي او د Biotinylated ضد dsRNA انټي باډي سره تړل کیږي.د انکیوبیشن وروسته غیر محدود HRP-Streptavidin مینځل کیږي.بیا د TMB سبسټریټ محلول د HRP لخوا اضافه کیږي او کتل کیږي ترڅو د نیلي رنګ محصول تولید کړي چې د تیزابي سټاپ محلول اضافه کولو وروسته په ژیړ بدلیږي.د ژیړ کثافت په پلیټ کې د نیول شوي dsRNA هدف مقدار سره متناسب دی.جذب په 450 nm اندازه کیږي.

غوښتنلیک

دا کټ د پاتې dsRNA کمي اندازه کولو لپاره دی.

د کټ اجزا

ذخیره او ثبات

1. د غیر استعمال شوي کټ لپاره: ټوله کټ د شیلف ژوند کې په 2~ 8℃ کې زیرمه کیدی شي.د ذخیره کولو ثبات لپاره باید د قوي رڼا څخه ډډه وشي.

2. د استعمال شوي کټ لپاره: یوځل چې مایکروپلیټ خلاص شي، مهرباني وکړئ غیر استعمال شوي څاګانې د پلیټ سیلر سره پوښ ​​​​کړئ او د ورق کڅوړې ته بیرته راشئ چې د ډیسیکینټ کڅوړه لري، د ورق کڅوړه زپ کړئ او د کارولو وروسته ژر تر ژره 2~ 8℃ ته بیرته راشئ.نور ریجنټونه باید د کارولو وروسته ژر تر ژره 2 ~ 8 ℃ ته بیرته راستانه شي.

اړین توکي خو نه دي ورکړل شوي

1. د مایکروپلیټ ریډر د 450 ± 10nm فلټر سره (ښه که چیرې په 450 او 650 nm طول موج کې کشف شي).

2. مایکروپلیټ شیکر.

3. د RNase وړیا لارښوونې او سینټرفیوج ټیوبونه.

د عملیاتو فلو چارټ

مخکې له دې چې تاسو پیل کړئ

1. د کارونې دمخه د کټ ټولې برخې او نمونې د خونې د حرارت درجه (18-25℃) ته راوړو.که چیرې کټ په یو وخت کې ونه کارول شي، مهرباني وکړئ یوازې د اوسنۍ تجربې لپاره پټې او ریجنټونه واخلئ، او پاتې پټې او ریجنټ په اړین حالت کې پریږدئ.

2. د مینځلو بفر: د 20x متمرکز واش بفر 40mL د 760mL deionized یا distilled اوبو سره ضعیف کړئ ترڅو د 1× واش بفر 800mL چمتو کړئ.

3. معیاري: د کارولو دمخه د ذخیره محلول په لنډ ډول سپن یا سنټرفیوج کړئ.د چمتو شوي څلورو معیارونو غلظت 5ng/μL دی.د UTP او pUTP dsRNA معیارونو لپاره، مهرباني وکړئ د سټنډرډ وکر د رسم کولو لپاره د سټارټ حل 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL ته د STE بفر سره کم کړئ.د N1-Me-pUTP dsRNA معیارونو لپاره، مهرباني وکړئ د سټنډرډ حل 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ته د STE بفر سره ضعیف کړئ ترڅو معیاري وکر راوباسي.د 5-OMe-UTP dsRNA معیاري لپاره، مهرباني وکړئ د سټنډرډ حل 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL ته د STE بفر سره ضعیف کړئ ترڅو معیاري وکر راوباسئ.موږ وړاندیز کوو چې معیارونه د لاندې چارټونو په توګه ضعیف شي:

4. Biotinylated کشف انټي باډي او HRP-streptavidin کاري محلول: د کارولو دمخه د ذخیره محلول په لنډه توګه سپن یا سنټرفیوج کړئ.دوی د کمولو بفر سره د کار غلظت ته کم کړئ.

5. د TMB سبسټیټ: د محلول د اړتیا وړ خوراک د تعقیم شوي لارښوونو سره وخورئ او پاتې محلول بیا په شیش کې مه اچوئ.د TMB سبسټیټ د رڼا سره حساس دی، د اوږدې مودې لپاره د TMB سبسټریټ رڼا ته مه رسوئ.

د پروتوکول کارول

1. د ارزونې لپاره د اړینو پټو شمیره مشخص کړئ.پټې د کارولو لپاره په چوکاټونو کې دننه کړئ.پاتې پلیټ پټې چې پدې ارزونه کې ندي کارول شوي باید په کڅوړه کې د ډیسیکینټ سره بیا ډک شي.د یخچال ذخیره کولو لپاره کڅوړه په کلکه وتړئ.

2. په مناسبو څاګانو کې د معیاري، خالي او نمونو هر یو 100μL اضافه کړئ.د پلیټ سیلر سره پوښ ​​​​کړئ.د خونې په حرارت کې د 1 ساعتونو لپاره په 500rpm کې د شاک کولو سره سینګار کړئ.نمونې باید د سمې ارزونې لپاره د مناسب غلظت لپاره د STE بفر سره ضمیمه شي.

3. د مینځلو مرحله: محلول د 250μL واش بفر سره هر څاه ته ومینځئ او پریږدئ چې د 30s لپاره ودریږي.په جاذبه کاغذ باندې د پلیټ په نیولو سره د مینځلو بفر په بشپړه توګه له مینځه یوسئ.په بشپړه توګه 4 ځله مینځل.

4. په هر څاه کې د 100μL بایوټینیل شوي کشف انټي باډي کاري محلول اضافه کړئ.د پلیټ سیلر سره پوښ ​​​​کړئ.د خونې په حرارت کې د 1 ساعتونو لپاره په 500rpm کې د شاک کولو سره سینګار کړئ.

5. د مینځلو مرحله تکرار کړئ.

6. په هر څاه کې 100μL HRP-streptavidin کاري محلول اضافه کړئ.د پلیټ سیلر سره پوښ ​​​​کړئ.د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره په 500rpm کې د شاک کولو سره.

7. د مینځلو مرحله بیا تکرار کړئ.

8. په هر څاه کې 100μL TMB سبسټریټ محلول اضافه کړئ.د پلیټ سیلر سره پوښ ​​​​کړئ.په RT کې د 30 دقیقو لپاره د رڼا څخه ساتنه وکړئ.مایع به د سبسټریټ محلول اضافه کولو سره نیلي شي.

9. په هر څاه کې 50μL سټاپ محلول اضافه کړئ.مایع به د سټاپ محلول اضافه کولو سره ژیړ شي.بیا د مایکروپلیټ ریډر چل کړئ او سمدلاسه په 450nm اندازه اندازه کړئ.

د پایلو محاسبه

1. د هر معیار، کنټرول، او نمونو لپاره د نقل لوستلو اوسط او د اوسط صفر معیاري نظری کثافت کم کړئ.په عمودی (Y) محور کې د جذب سره او په افقی (X) محور کې د dsRNA غلظت سره یو معیاري وکر جوړ کړئ.

2. دا سپارښتنه کیږي چې محاسبه د کمپیوټر پر بنسټ د منحني فټینګ سافټویر سره ترسره کړئ لکه د منحني ماهر 1.3 یا ELISA Calc په 5 یا 4 پیرامیټر غیر خطي فټ ماډل کې.

فعالیت

1. حساسیت:

د کشف ټیټ حد: ≤ 0.001pg/μL (د UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA لپاره)، ≤ 0.01pg/μL (د 5-OMe-UTP-dsRNA لپاره).

د مقدار ټیټ حد: 0.0156 pg/μL (د UTP-, pUTP-dsRNA لپاره)، 0.0312 pg/μL (د N1-Me-pUTP-dsRNA لپاره)، 0.0625 pg/μL (د 5-OMe-UTP-dsRNA لپاره).

2. دقیقیت: د انټرا اسیس CV ≤ 10٪، د انټرا اسیس CV ≤ 10٪

3. رغونه: 80٪ ~ 120٪

4. خطاطي: 0.0156-0.5pg/μL( forUTP-,pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA)، 0.0625-1pg/μL (د 5-OMe-UTP-dsRNA لپاره).

غورونه

1. د TMB عکس العمل تودوخه او وخت مهم دی، مهرباني وکړئ دوی د لارښوونې سره سم په کلکه کنټرول کړئ.

2. د دې لپاره چې د ارزونې ښه تولید او حساسیت ترلاسه کړي، د پلیټونو په سمه توګه مینځل اړین دي چې اضافي غیر عکس العمل ریجنټونه لرې کړي.

3. ټول ریجنټونه باید د کارولو دمخه په ښه توګه سره مخلوط شي او د نمونې یا ریجنټ اضافه کولو په وخت کې د bumbles څخه مخنیوی وشي.

4. که چیرې کرسټالونه په متمرکز واش بفر (20x) کې جوړ شوي وي، تر 37 ℃ پورې تودوخه او په نرمۍ سره مخلوط کړئ تر هغه چې کرسټال په بشپړه توګه منحل شي.

5. د سوډیم ازایډ (NaN3) د نمونو د ارزونې څخه ډډه وکړئ، ځکه چې دا کولی شي د HRP فعالیت له منځه یوسي چې په پایله کې د dsRNA مقدار کم اټکل کیږي.

6. د ارزونې پرمهال د RNase ککړتیا څخه مخنیوی وکړئ.

7. معیاري/ نمونه، د کشف انټي باډي او SA-HRP هم په RT کې پرته له ټکولو ترسره کیدی شي، مګر دا کیدای شي د کشف حساسیت یو چنده کم شي.د دې قضیې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې د UTP او pUTP dsRNA معیارونه باید له 2pg/μL څخه کم شي، د N1-Me-pUTP dsRNA معیارونه باید له 4pg/μL څخه کم شي او د 5-OMe-UTP dsRNA معیارونه باید له 8pg/μL څخه کم شي.برسېره پردې، د خونې په حرارت کې د 60 دقیقو لپاره د HRP-streptavidin کاري محلول وخورئ.د فلاسک شیکر مه کاروئ، ځکه چې د فلاسک شیکر کیدای شي ناسمه پایله ولري.

عادي پایله

1. معیاري منحني ډاټا

2. معیاري منحني محاسبه

3. د لاینر کشف رینج: 0.0312- 1pg/μL